高效液相色谱法测定聚乙烯吡咯烷酮

文/戴鹏¹，刘炳荣¹，汪毅¹，陶丽琴¹，刘峰^2*

1. 江西三鑫医疗科技股份有限公司；2. 南昌大学

摘要：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一种具有天然表面活性的多功能聚合物，由于其分子量分布范围广，两亲性强，很难准确定量测定。本研究建立了高效液相色谱（HPLC）检测K85-聚乙烯吡咯烷酮的定量分析方法，并对色谱检测条件进行了优化。该分析方法使用Inertsil ODS-SP C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈与水的混合液（10∶90，v∶v），流速为1.0mL/min，检测波长为205nm。运用所建立的方法进行测定时，将聚合物解析为单峰，出峰时间tR=（5.705±0.005min。检测过程中，色谱柱性能保持不变，峰形保持良好。在5～100μg/mL呈现良好的线性关系（R²=0.998 8，n=5），检测限为18.9ng/mL，定量限为57ng/mL。3次平行添加实验显示，平均回收率分别为99.50%、99.99%、100.64%，RSD值分别为0.996%、0.857%、0.674%。该方法适用于PVP从聚砜类透析膜上洗脱量的相关测定。

关键词：高效液相色谱（HPLC）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；线性关系

Determination of Polyvinylpyrrolidone by High Performance Liquid Chromatography

DAI Peng1, LIU Bingrong1, Wang Yi1, Tao Liqin1, LIU Feng2*

(1.Jiangxi Sanxin Medical Science and Technology Co., Ltd., Nanchang 330200,China;2.Nanchang University, Nanchang 330031, China)

Abstract: Polyvinylpyrrolidone (PVP) is a versatile polymer with innate surface activity. It is very difficult to accurately determine the quantity of PVP due to its wide molecular weight range and amphiphilic nature. In this study,an analytical method for the quantitative detection of K85-PVP by high performance liquid chromatography (HPLC) is established, and the chromatographic conditions are optimized. The described analytical method uses an Inertsil ODSSP C₁₈ column (250mm×4.6mm, 5μm), a mixture of acetonitrile and water as the mobile phase (10∶90, v∶v),with a flow rate of 1.0 mL/min and a detection wavelength of 205 nm. During the determination, the polymeris resolved into a single peak, establishing the peak time tR=(5.705±0.005)min. Throughout the detection and research process,the performance of the chromatographic column remained unchanged and the peak shape remained good. A good linear relationship exists in the concentration range of 5～100μg/mL (R²=0.998 8, n=5), with the detection limit 18.9ng/mL and the quantification limit 57 ng/mL. Three parallel additional experiments show that the average recoveries are 99.50%, 99.99%, 100.64%, and the RSD values are 0.996%, 0.857%, 0.674%, respectively. The method herein described is suitable for the quantitative determination of the elution volume of PVP from polysulfone type dialysis membranes.

Keywords: high performance liquid chromatography; polyvinylpyrrolidone (PVP); linear relationship

0、前言

聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）是一种内酰胺型水溶性聚合物，结构上含有高极性酰胺键和非极性亚甲基部分，也是一种两亲性聚合物。PVP是N-乙烯基吡咯烷酮的水溶液经过过氧化氢催化多步聚合而成，通过控制聚合度，可以得到较宽范围分子量的聚合物（几千至几百万道尔顿）^[1]。该分子在溶液中以松散无规则卷曲的形式存在，可溶于多种有机溶剂^[2]。PVP在二战前期被广泛用作血浆替代品，尽管大多数进入人体的PVP通过肾脏排出，但剩余少部分大分子量PVP会在肝、肾、肺、胰腺和淋巴结中永久性积聚，导致器官损伤或衰竭。因此，在战后时期，PVP作为血浆替代品被禁止使用^[3-4]。现在主要被用于食品添加剂、控释赋形剂和透皮渗透促进剂，以及聚砜类血液透析膜的亲水剂和致孔剂^[5-7]。

据文献报道，用于量化PVP的分析方法包括折射法、比色法、红外和荧光光谱法^[8]。1968年，德国科学家穆勒^[9]采用0.006mol/L碘溶液通过碘络合法测量PVP浓度，结果表明该浓度的碘溶液适用于测量高分子量的PVP，如K90，但无法测定低分子量的PVP，如K30，且该方法对于辐照灭菌之后的PVP 含量测定同样不适用^[10-11]。随着PVP在食品和医疗器械方面的广泛使用，不同规格型号PVP的定量测定就显得越来越重要。SHIMAMOTO等^[11] 和TAVLARAKIS等^[12]使用高效液相色谱测定PVP的浓度，但使用的流动相配比复杂、色谱柱昂贵，而且测量的线性范围较小。

目前，国内外使用的技术不具有将PVP与配方内其他赋形剂分离的能力，并且在灵敏度方面存在一定的局限性。与上述其他分析技术相比，HPLC在分析速度和准确度方面具有一定的优势，本研究旨在建立一种HPLC测定PVP含量的方法，且适用于经辐照灭菌的各类食品、药品及医疗器械。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈，色谱纯，西陇科学股份有限公司；实验用水，超纯水，自制（当天使用）；聚乙烯吡咯烷酮标准品，纯度99%，上海西宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Master-Touch-DUVF型制水机，上海和泰仪器有限公司；尼龙针头滤膜，孔径0.45μm，天津市科亿隆实验设备有限公司；K85-聚乙烯吡咯烷酮，巴斯夫中国有限公司（BASF）；KQ-300DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LC-20AT型高效液相色谱仪（配有紫外检测器），日本SHIMADZU公司；Inertsil ODS-SP C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm），日本SHIMADZU公司；AR224CN分析天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准储备溶液的配制

使用分析天平称取1.0g聚乙烯吡咯烷酮标准品于250mL烧杯中，加适量超纯水溶解，用超声波清洗器辅助溶解，完全溶解后置于1000mL棕色容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1.0mg/mL的标准溶液，避光保存。

1.3.2 标准曲线的绘制

分别使用微量移液枪量取0.5mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL 和10.0mL新配制的上述标准储备溶液于100mL棕色容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，配制成5g/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL和100μg/mL的系列标准使用溶液，避光保存，用于标准曲线的绘制。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈∶水=10∶90（v∶v），等度洗脱；流速：1.0mL/min；检测波长：205nm；柱温：30℃；进样体积：20μL。

1.3.4 检测限（LOD）和定量限（LOQ）

检测限（LOD）指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量；定量限（LOQ）指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。检测限和定量限按式（1）和式（2）计算。

LOD=3.3σ/S （1）

LOQ=10σ/S （2）

式中：σ表示设备检测器响应的标准偏差；S表示标准曲线的斜率。

1.3.5 精密度和回收率

使用分析天平称取K85-聚乙烯吡咯烷酮标准品40.0mg，分别添加至5mg/L、20mg/L、50mg/L 的溶液中，振荡摇匀，用超纯水定容至1L，得到45mg/L、60mg/L、90mg/L 3个添加浓度水平，每个浓度平行测定6次，记录实验结果。

2、结果与分析

2.1 标准曲线

实验中分别对浓度为5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL和100μg/mL的系列标准溶液进样分析。结果表明，K85-PVP的最大紫外吸收波长为205nm，其出峰时间为（5.705±0.005）min，整体测试时间保持在10min左右，具体见图1。整个研究过程中，色谱柱性能保持不变，峰形保持良好，且在5～100μg/mL的浓度范围内PVP线性良好，线性方程为Y=75.786 5X+377.790，相关系数为0.999 4，标准曲线见图2。

2.2 检测限（LOD）和定量限（LOQ）

由测试结果可知，测试样品浓度为5μg/mL时，样品峰高约为70mV，噪音峰高为80μV，故推算得到该方法的检测限（LOD）的峰高响应值约为264μV，对应的样品浓度值约为18.9ng/mL；定量限（LOQ）的峰高响应值约为800μV，则对应的样品浓度值约为57ng/mL。

联合国粮食农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）在关于食品添加剂的联合专家会议（Joint Expert Committee for Food Additives，JECFA） 中将PVP的每日可接受量（Accepted Daily Intake，ADI）定为每公斤体重0～50mg^[13]。同时，国内医疗器械质量检测中心将透析器（PVP）致孔剂的残留标准设置为＜300mg/支。故以上限量基本可以满足国内外对于PVP含量的检测要求。

2.3 精密度和回收率

采用加标回收的方式评价高效液相法测定PVP的精密度和回收率，数据结果见表1。按照1.3.3色谱条件对3批样品分别连续进样测试6次，峰面积的RSD值均在2%以内，标准品平均回收率分别为99.50%、99.99%、100.64%，表明该方法适用于K85-PVP的样品测试。

3、讨论

目前，用于量化PVP的方法包括比色法、红外和荧光光谱法等，相较于以上方法，本研究方法更加精准且能去除其他赋形剂的影响。本文对色谱条件的优化主要为以下几方面：

（1）考虑到PVP的分离效果问题，本实验筛选了常用的溶剂体系，如甲醇- 水、乙腈-水。结果发现在甲醇-水体系中，目标峰（出峰时间5.705min）与杂质峰（出峰时间5.3min左右）重叠；乙腈-水体系中，目标峰（出峰时间5.705min）与杂质峰（出峰时间5.3min左右）彻底分离，故最后选定乙腈- 水作为流动相。

（2）实验对流动相的比例进行优化。乙腈∶水=15∶85（v∶v）时，目标峰（出峰时间5.705min）与杂质峰重叠，且所有成分出峰时间均被压缩至7min以内；当乙腈∶水=10∶90（v∶v）时，目标峰（出峰时间5.705min）与杂质峰彻底分离，且所有成分出峰时间适中，10min之内所有成分峰均可得到分离，分离效率较高；当乙腈∶水=5∶95（v∶v）时，目标峰（出峰时间5.705min）与杂质峰分离，但所有成分出峰时间均被延后，需要16min所有成分峰才能完全分离，分离效率较低。考虑到出峰时间和分离效果问题，最后选定乙腈∶水=10∶90（v∶v）作为流动相比例。

（3）流动相流速的优化。当流动相流速为1.0mL/min时，目标峰分离度为100%，总出峰时间10min；当流动相流速为1.5mL/min时，目标峰分离度为80%，总出峰时间为7.5min，故选取流动相流速为1.0mL/min为最终实验条件。

（4）对PVP标准储备溶液进行紫外全光谱扫描，得到最高吸收波长为205nm，故选定吸收波长205nm作为实验条件；此外，实验柱温选择的是色谱柱推荐的使用柱温30℃。

4、结论

高效液相色谱法是一种适合分析K85-PVP的方法，能够将K85-PVP与聚合物中其他的赋形剂分离，本文采用等度洗脱法在10min内成功地将K85-PVP聚合物分离成单峰。目前，PVP常用碘络合的方法进行定量，此类方法的精密度、适用性均不能满足现在医疗器械检测的要求，通过进一步的研究工作，有望开发具有更高分辨率的高效液相色谱技术，并将其用于分离和量化不同等级的PVP混合物，使之适用于医疗器械血液透析器中PVP的溶出测试等。

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本文转载自《生物化工》2023年第2月第9卷第1期