麦霭平
(广东省迪美生物技术有限公司，广东 广州 510070)
摘要：在借鉴国外一些成熟产品配方基础上，本文采用二元、三元复配防霉体系对12种霉菌进行了抑菌效果研究，结果发现在维持低成本的前提下，二元复配体系的抗菌效果不是很理想，而三元复配体系的抗菌效果良好。综合MIC实验的结果，选取对各种霉菌抑菌效果较强、成本较低、适合应用于水性涂料的BDY、B03和D05为防霉有效成分。
关键词：涂料防霉剂;复配;协同效应
Study on the Development of Combined Antifungal Agents
Used in the coating
MAI ai-ping
(Guangdong Demay Biological Technolgy Co.,Ltd,
Guangdong, Guangzhou 510070, china)
Abstract
Based on the formulas of some mature products abroad, the present research makes a study on the antibacterial effects of the two-factor and three-factor compound antimildew systems on 12 kinds of mould. The results show that with the same low cost, the antibacterial effect of the three-factor compound system is better than that of the two-factor one. Combing with the results of the MIC experiment, the present researcher picks out BDY, B03 and D05 as effective antimildew factors, which are able to kill any kind of mould, cost little, and can be applied in water-based paints.
Key words: Paint Fungicides;combination;Synergy
涂料防霉剂研究是一门新兴的边缘学科，近年来已引起世界各国的普遍重视，我国目前还没有独立的防霉研究机构，但防霉剂在涂料行业已广泛推广应用，对该课题的研究具有重要的市场意义。近年来，对涂料防霉剂防霉效能的研究发方法主要有抑菌圈法[1]，和最低抑菌浓度法。抑菌圈法是半定量的方法，而最低抑制浓度法为定量的方法，因此本试验采用“最低抑菌浓度”作为防霉剂的效果评价方法。
在本文的研究中，我们发现单一的防霉剂不能对所有的霉菌都起到抑制作用，而将多种防霉剂合理的复配，能够提高药效，扩大防治范围，降低毒性，减少用量，降低生产和使用成本，节省劳力，延长现有防霉剂品种的使用寿命，以至开辟新的用途，从而达到以较少的投入取得较大的效益。但是，若混用不当，则可能造成药剂有效成分分解或理化性质变坏而降低药效。因此,涂料防霉剂的复配必须遵循以下的原则：(1) 选择作用机制或作用位点不同的防霉剂进行复配,且无抗药性；(2) 复配后具有增效作用或加合作用；(3) 各单组分防霉剂的原料易得,价格低廉；(4) 复配的各组分之间不能发生化学反应；(5) 复配后的产品,其毒性要低；(6) 添加复配型防霉剂后不能影响皮革的性能；(7) 根据要防治的对象来选择复配的化合物及比例。
1 实验部分
1.1 主要材料及仪器
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），广东环凯生物技术有限公司；
磷酸缓冲液（0.03 mol/L），自制；
B01（农药级），江门农药厂；
B02（农药级），江门农药厂；
B03（工业级），浙江；
BDY（工业级），大连；
C01（工业级），盐城市旭星化工有限公司；
C02（工业级），盐城利民农化有限公司；
C08（工业级），宜兴市大明化工有限公司；
D01（农药级），北京乐农四方生物科技开发有限公司；
D02（农药级），河南省原阳县农药厂；
D05（工业级），浙江；
加样器（1μL~10μL）
恒温水槽（DKB-501A），广东环凯生物技术有限公司；
吸管；试管；平皿；
电热恒温培养箱（DNP-9272），广东环凯生物技术有限公司
1.2 实验方法
1.2.1 最低抑菌浓度实验[2]
最低抑菌浓度（MIC）实验是表示防霉剂完全抑制某种微生物生长所需要的最小浓度，所以防霉剂的MIC值越小，表明这种防霉剂的毒力越高，应用效果会越好。MIC值已经成为防霉剂的研制、生产、应用人员对防霉剂效果认识的一项最基本的数据。
霉菌的最低抑菌浓度（MIC）法一般采用琼脂稀释，即制备不同防霉剂含量的系列培养基平板，在系列培养基上接种测试微生物，培养一定时间后，根据试验菌种在各种浓度防霉剂的培养基上能否生长发育，确定防霉剂对这一微生物的最低抑制浓度，该法适用于不溶性与可溶性防霉剂的检测。MIC试验法是一种半定量至定量的方法，能比较好地反映出防霉剂毒力的大小，便于不同防霉剂之间抑菌效果的比较，是目前防霉剂最常见的抑杀性能表达方式之一。
具体步骤如下：
（1）培养基制备
使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，称取40.1g，加入去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，然后经高温高压（121℃、0.1MPa）灭菌20分钟。
（2）含药琼脂平板制备
根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的防霉剂分别加入已加热溶解，并在45～50℃水浴中平衡的PDA琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3～4mm。
通常按1∶9比例配制防霉剂琼脂平板，根据需要来选择防霉剂浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中。
（3）接种物制备与接种
用5.0 mL吸管吸取 3.0 mL～5.0 mL稀释液加入新鲜的霉菌斜面培养试管内，洗下菌苔。随后，用5.0 mL吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20秒，或在手掌上振敲80次，以使霉菌悬浮均匀。用加样器吸取制备好菌液约1～2 μL（含菌量约为107 cfu/mL）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104 cfu。接种好后置30 ℃培养72小时，观察结果。
（4）结果判断
将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制霉菌生长的最低药物浓度为MIC。如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
本文实验采用的菌种。
从涂料建筑物受微生物污染的层上取回的污染涂膜，从中分离纯化的典型菌种，从受污染涂膜上得到的优势霉菌属有：少根霉(Rhizopusarrhizus)、聚多曲霉(Asp. sydowii)、链隔孢（Alt. alternats）、黄曲霉(Asp. flavus)、杂色曲霉(Aspergillus uersicolor)、出芽短梗霉霉(Aureobasidium pullulans)、半帚霉属(Leptographium sp.)、腐质霉属(Humicola sp.)、巨大曲霉(Asp. giganteus)、黑曲霉(Asp. niger)、黑根霉(Rhi.nigricans)、肉色曲霉(Asp. carneus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、蜡叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)、桔青霉(Penicillium citrinum)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)、酿酒酵母(S. cerevisiae)、球毛壳霉(Chaetomium globosum)、米根霉(Rhi. oryzae)、常见青霉(Pen. freguentans)、黄绿青霉(Pen. citreo-viride)、产黄青霉(Pen. chrysogenum)、曲霉属[棒曲霉（Aspergillus clavat），烟曲霉原变种（A. fumigatus），日本曲霉原变种（A. japonicus var.japonicus），寄生曲霉（A. parasiticus），聚多曲霉（A. sydowii），土曲霉原变种（A. terreus），炭黑曲霉(A.carbonarius)]，还有青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）、镰刀菌属（(Fusarium）和粗壮串珠霉（Thielaviopsis）。其中最常见的是曲霉属和青霉属占优势，其次是短梗霉属、根霉属、毛霉属、木霉属和交链孢属等。
因此我们选用了球毛壳霉、黑曲霉、黄曲霉、绳状青霉、绿色木霉、杂色曲霉、拟青霉、桔青霉、酿酒酵母、蜡叶芽枝霉、出芽短梗霉和土曲霉作为本实验抑菌最低浓度的试验对象。
1.2.2 多元复配防霉剂
首先本试验对大量的防霉剂进行单一组分的最低抑菌浓度测试，对mic值进行分析，选取几组mic值较低的防霉剂。再对防霉剂进行二元复配，并结合国外的一些防霉剂配方，选取合适的组分和比例进行复配，并对其mic值进行分析。在mic较低的组合中，我们再考虑价格因素，对防霉组分进行三元复合，最终得到性价比最优的涂料防霉剂。
2 实验结果与讨论
对常用的大量防霉剂进行霉菌的最低抑菌浓度试验，其MIC值结果如表1所示。
表1 单一防霉剂对试验菌种的MIC(单位：mg/kg)
防霉剂代号 |
球毛壳霉 |
黑曲霉 |
黄曲霉 |
绳状青霉 |
绿色木霉 |
杂色曲霉 |
拟青霉 |
桔青霉 |
酿酒酵母 |
蜡叶芽枝霉 |
出芽短梗霉 |
土曲霉 |
市场成本 |
B01 |
100 |
200 |
200 |
600 |
500 |
100 |
600 |
700 |
500 |
2000 |
500 |
500 |
|
B02 |
800 |
300 |
200 |
600 |
500 |
100 |
1000 |
500 |
500 |
5000 |
500 |
600 |
|
B03 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
>500 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
>500 |
<10 |
<10 |
～40元/kg |
BDY |
<10 |
<10 |
20 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
10 |
<10 |
20 |
10 |
～350元/kg |
C01 |
100 |
100 |
200 |
600 |
500 |
100 |
600 |
700 |
500 |
5000 |
500 |
600 |
|
C02 |
500 |
200 |
100 |
600 |
500 |
100 |
600 |
700 |
500 |
>5000 |
500 |
1000 |
|
C08 |
20 |
80 |
70 |
300 |
60 |
60 |
60 |
60 |
>500 |
>500 |
20 |
100 |
～40元/kg |
D01 |
100 |
200 |
200 |
100 |
500 |
100 |
600 |
600 |
500 |
>5000 |
500 |
500 |
|
D02 |
500 |
200 |
200 |
100 |
500 |
100 |
600 |
700 |
500 |
>5000 |
500 |
60 |
|
D05 |
20 |
60 |
80 |
>500 |
60 |
60 |
60 |
60 |
200 |
>500 |
20 |
240 |
～40元/kg |
根据表1，总体上来讲，上述单一品种的防霉剂对球毛壳霉、黑曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、出芽短梗霉、土曲霉具有较好的抑菌效果，MIC值相对较低；而对蜡叶芽枝霉的抑菌效果相对较差，MIC值比其他霉菌要高出许多。
就单一品种的防霉剂对所测试霉菌的抑菌效果而言，防霉剂C01、C02、B01、B02、D01、D02对所测试霉菌的抑菌效果较差，MIC值都在100以上，甚至对个别霉菌的MIC>5000。B03、BDY、C08、D05的抑菌效果较好，对表1所测试的12种霉菌中的9种以上的MIC值都在100以内；其中BDY的抑菌效果最强，对所测试的12种霉菌的MIC值都在20以内。B03、C08、D05对蜡叶芽枝霉的抑菌效果均较差，MIC>500，仅BDY对蜡叶芽枝霉的抑菌效果好，其MIC<10。
由于效果最好的BDY市场价格约为350元/kg，而效果次之的B03、C08、D05市场价格均在40元/kg左右，故单纯采用BDY作为防霉体系的有效成分是不经济的。根据单一品种防霉剂的抑菌效果，基于我们之前剖析的一些国外成熟产品配方的经验，结合防霉剂目前的市场价格，我们采用尝试法对防霉体系进行了二元复配，并测试了其对12种霉菌的最低抑菌浓度，其MIC值结果如表2所示。
由于B03仅对绿色木霉和蜡叶芽枝霉的抗菌效果较差，而C08，D05这两个防霉剂对绿色木霉的抗菌效果比B03要好，首先组成两个二元复配体系，即m（B03）：m（C08）=1：1与m（B03）：m（D05）=1：1。由表2可知，这两个复配体系对绿色木霉和蜡叶芽枝霉的抗菌效果没有得到提高。
表2 二元复配防霉剂对试验菌种的MIC(单位：mg/kg)
配方编号 |
防霉剂代号 和复配比例 |
球毛壳霉 |
黑曲霉 |
黄曲霉 |
绳状青霉 |
绿色木霉 |
杂色曲霉 |
拟青霉 |
桔青霉 |
酿酒酵母 |
蜡叶芽枝霉 |
出芽短梗霉 |
土曲霉 |
I |
m(B03):m(C08)=1:1 |
<10 |
<10 |
<10 |
300 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
>500 |
<10 |
<10 |
II |
m(B03):m(D05)=1:1 |
<10 |
<10 |
<10 |
>500 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
>500 |
<10 |
<10 |
III |
m(BDY):m(B03)=5:95 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
200 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
300 |
<10 |
<10 |
IV |
m(BDY):m(B03)=10:90 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
20 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
80 |
<10 |
<10 |
V |
m(BDY):m(C08)=10:90 |
<10 |
<10 |
<10 |
20 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
200 |
100 |
<10 |
<10 |
VI |
m(BDY):m(D05)=10:90 |
<10 |
<10 |
<10 |
100 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
10 |
100 |
<10 |
<10 |
将B03，C08，D05与抗菌效果最好的BDY分别进行复配，MIC测试结果如下：二元复配体系（III＃）m（BDY）：m（B03）=5：95对12种霉菌中的10种的MIC值都在10以内，但是对绿色木霉和蜡叶芽枝霉的的MIC值在300左右。与B03相比，二元复配体系（IV＃）m（BDY）：m（B03）=10：90的防霉效果有所提高，对绿色木霉和蜡叶芽枝霉的的MIC值在100以内。二元复配体系（V＃）m（BDY）：m（C08）=10：90，对蜡叶芽枝霉，出芽短梗霉的MIC值在100以上；二元复配体系（VI＃）m（BDY）：m（D05）=10：90对绳状青霉和芽短梗的MIC值为100。
鉴于抗菌效果较好的二元复配体系中BDY的量较高，复配产品的价格仍偏高，因此进一步研究了降低BDY含量的三元复配体系的性能，其MIC值结果如表3所示。
表3 三元复配防霉剂对试验菌种的MIC(单位：mg/kg)
配方编号 |
防霉剂代号 和复配比例 |
球毛壳霉 |
黑曲霉 |
黄曲霉 |
绳状青霉 |
绿色木霉 |
杂色曲霉 |
拟青霉 |
桔青霉 |
酿酒酵母 |
蜡叶芽枝霉 |
出芽短梗霉 |
土曲霉 |
VII |
m(B03):m(C08):m(D05)=45:10:45 |
20 |
50 |
50 |
400 |
60 |
80 |
80 |
60 |
500 |
500 |
20 |
200 |
VIII |
m(BDY):m(B03):m(C08)=5:50:45 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
100 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
100 |
<10 |
<10 |
IX |
m(BDY):m(B03):m(D05)=5:50:45 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
100 |
<10 |
<10 |
X |
m(BDY):m(C08):m(D05)=5:50:45 |
<10 |
<10 |
<10 |
40 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
100 |
100 |
<10 |
<10 |
由表3可知，三元复配体系（VII＃）m（B03）：m（C08）：m（D05）=45：10：45，对绳状青霉，酿酒酵母和蜡叶芽枝霉的MIC值为400以上，对土曲霉的MIC值为200，对其它8种霉菌的MIC值均在100以内，抗菌效果并不理想。三元复配体系（VIII＃配方）m（BDY）：m（B03）：m（C08）=5：50：45，对绿色木霉和蜡叶芽枝霉的MIC值为100，对其它10种霉菌的MIC值<10，抗菌效果较好。三元复配体系（IX＃配方）m（BDY）：m（B03）：m（D05）=5：50：45，对蜡叶芽枝霉的MIC值为100，对其它11种霉菌的MIC值<10，抗菌效果较强。三元复配体系（X＃配方）m（BDY）：m（C08）：m（D05）=5：50：45对绳状青霉的MIC值为40，对酿酒酵母和蜡叶芽枝霉MIC值为100，对其它9种霉菌的MIC值<10。
3 结论
综合MIC实验的结果，如果以对各种霉菌抑菌效果较强、成本较低，适合应用于涂料的三元复配体系为目标，可选取（IX＃）m（BDY）：m（B03）：m（D05）=5：50：45配方；如果目标中没有酿酒酵母和蜡叶芽枝霉，则可以选取（X＃）m（BDY）：m（C08）：m（D05）=5：50：45配方作为防霉剂悬浮体系中的防霉有效成分。对于不同的目标，都可以依此类推。
参考文献
[1] 复配型皮革防霉剂的研究(Ⅱ)--多组分防霉剂的复配效果及比例的确定[J].皮革科学与工程,2005:(6)11-14.
[2] 工业杀菌剂[M].化学工业出版社,2001:100-103.
文章发表于《广州化工》2010年38卷第12期
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